Reaksi-Reaksi Spesifik Pada Protein

Protein merupakan urutan linear dari residu asam-asam amino yang terhubung melalui ikatan peptide. Ikatan peptide adalah ikatan kovalen antara gugus-amino dari satu asam amino dan gugus-karboksil dari asam amino dan gugus-karboksil dari asam amino yang lain. Ikatan peptida memiliki karakter ikatan rangkap parsial dan hamper selalu dalam konfigurasi trans. Ketika dua asam amino digabungkan oleh ikatan peptide, mereka membentuk sautu dipeptida. Penambahan asam amino seterusnya mengahsilkan rantai panjang yang disebut oligopeptida dan polipeptida.

Protein merupakan polimer yang tersusun dari asam amino sebagai monomernya. Monomer-monomer ini tersambung dengan ikatan peptida, yang mengikat gugus karboksil milik satu monomer dengan gugus amina milik monomer di sebelahnya. Reaksi penyambungan ini (disebut translasi) secara alami terjadi di sitoplasma dengan bantuan ribosom dan tRNA. Pada polimerisasi asam amino, gugus -OH yang merupakan bagian gugus karboksil satu asam amino dan gugus -H yang merupakan bagian gugus amina asam amino lainnya akan terlepas dan membentuk air. Oleh sebab itu, reaksi ini termasuk dalam reaksi dehidrasi. Molekul asam amino yang telah melepaskan molekul air dikatakan disebut dalam bentuk residu asam amino. 

Asam amino adalah sembarang senyawa organik yang memiliki gugus fungsion alkarboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut atom C "alfa" atau α). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein 

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun dengan menggunakan asam, dengan cara ini diperoleh campuan bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kualitasnya masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut

Struktur protein dapat dilihat sebagai hirarki, dimana terdapat empat struktur pada protein dengan bentuk dan ciri khas masing-masing yang dimana struktur protein tidak stabil terhadap beberapa faktor, keempat struktur protein yaitu berupa struktur primer, sekunder, tersier dan kuartener (Lestari, 2011) yaitu;

1.  Struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Frederick Sanger merupakan ilmuwan yang berjasa dengan temuan metode penentuan deret asam amino pada protein, dengan penggunaan beberapa enzim protease yang mengiris ikatan antara asam amino tertentu, menjadi fragmen peptida yang lebih pendek untuk dipisahkan lebih lanjut dengan bantuan kertas kromatografik. Urutan asam amino menentukan fungsi protein, pada tahun 1957, Vernon Ingram menemukan bahwa translokasi asam amino akan mengubah fungsi protein, dan lebih lanjut memicu mutasi genetik.

2. Struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai berikut:

Ø  Alpha helix (α-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asam-asam amino berbentuk seperti spiral;

Ø  Beta-sheet (β-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);

Ø  Beta-turn, (β-turn, "lekukan-beta"); dan

Ø  Gamma-turn, (γ-turn, "lekukan-gamma").

3. Struktur tersier yang merupakan gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan.Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener.

4. Struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin.

Struktur primer protein bisa ditentukan dengan beberapa metode: (1) hidrolisis protein dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid analyzer, (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3) kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan massa molekular dengan spektrometri massa. Struktur sekunder bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red  (FTIR). Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm.Estimasi dari komposisi struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD.Pada spektrum FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I dari lempeng-beta.Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa diestimasi dari spektrum inframerah 

Denaturasi ada dua macam yaitu (Lehninger,1990) : 

- Pengembangan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi kecil tanpa diikuti pengembangan molekul seperti pada polipeptida. 

- Denaturasi yang tergantung pada keadaan molekul seperti pada bagian molekul yang tergabung dalam struktur sekunder. 

Karena itu denaturasi dapat berarti suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur sekunder, tersier dan kuartener molekul protein tanpa terjadi pemecahan ikatan kovalen. Atau dapat pula diartikan sebagai suatu proses pecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan Van der Waals, dan terbuka atau tidaknya ikatan molekul. Pada umumnya protein yang sudah didenaturasikan kelarutannya berkurang atau hilang sama sekali, dan ada pula yang membentuk endapan pada bagian dasar larutan. Hal ini disebabkan karena lapisan protein bagian dalam yang bersifat hidrofobik terbalik keluar dan bagian luarnya yang bersifat hidrofil terlipat ke dalam atau kebalikannya, terutama jika larutan protein telah mendekati pada isoelektrik hingga protein menggumpal dan akhirnya mengendap (Lehninger,1990).

Reaksi-Reaksi Spesifik Pada Protein:

1. Reaksi Xantoprotein 

Uji xantoprotein merupakan uji kualitatif pada protein yang digunakan untuk menunjukkan keberadaan gugus benzene. Metode analisis protein ini menggunakan larutan asam nitrat pekat, yang merupakan salah satu asam pekat. Larutan asam nitrat ini ditambahkan dengan ke dalam larutan protein. Setelah kedua larutan tersebut tercampur maka akan terjadi reaksi ini sehingga terbentuk endapan berwarna putih. Langkah selanjutnya dilakukan pemanaskan terhadap larutan tersebut, pada tahapan ini endapan berwarna putih akan berubah warna menjadi kuning. Reaksi perubahan yang terjadi tersebut disebut nitrasi pada inti dari benzena yang terdapat pada molekul dari protein. Hasil positif pada uji xantoprotein adalah munculnya gumpalan atau cincin warna kuning. Pada uji ini, digunakan larutan asam nitrat yang berfungsi untuk memecah protein menjadi gugus benzena. Asam amino yang menunjukkan reaksi positif untuk uji ini, yaitu tyrosin, phenilalanin dan tryptophan. Protein yang mengandung residu asam amino dengan radikal fenil dalam struktur kimianya (protein yang mengandung asam amino fenilalanin atau tirosin) jika ditambahkan dengan asam nitrat pekat akan terbentuk gunpalan warna putih. Pada pemanasan, warna gumpalan putih tersebut akan berubah menjadi kuning yang akhirnya berubah menjadi jingga jika ditambah dengan larutan basa. Sebenarnya, proses ini dapat terjadi jika kulit terkena asam nitrat pekat, yang segera menjadi kuning karena terjadinya proses nitrasi inti benzena pada asam amino penyusun kulit. Pada senyawa yang bukan asam amino akan memberikan hasil negatif, seperti kolagen dan gelatin.

2. Reaksi Sakaguci 

membuktikan adanya gugus guanidin (atom C yang mengikat N2 dengan ikatan tunggal dan mengikat N dengan ikatan ganda).Uji ini dibuktikan dengan sampel protein ditambah pereaksi Sakaguchi (naftol + natrium hipobromit), menghasilkan warna merah

3. Reaksi Hopkins-Cole

Pereaksi Hopkins-cole dibuat dari asam oksalat dan serbuk magnesium dalam air. Pereaksi ini positif terhadap protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping indol, seperti pada asam amino triptofan.

Triptofan memberikan hasil yang positif dengan tes Hopkins-cole karena mengandung gugus indol.

Dalam pereaksi ini, asam oksalat direduksi menjadi asam glioksilat dengan bantuan katalis serbuk magnesium:

	Mg
HOOC – COOH	→	HOOC – COH
Asam oksalat		Asam glioksilat

 Asam glioksilat yang terbentuk mengkondensasi asam amino triftofan membentuk senyawa berwarna. Setelah H₂SO₄ pekat dituangkan, akan terbentuk dua lapisan dan beberapa saat kemudian terbentuk cincin ungu di antara batas kedua lapisan itu.

4. Tes Millon

Pereaksi Millon adalah campuran larutan raksa (I) nitrat dan raksa (II) nitrat dalam asam nitrat. Jika pereaksi Millon ditambahkan ke dalam larutan protein, akan dihasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah akibat pemanasan.

Tirosin memberikan hasil yang positif dengan tes Millon karena mengandung gugus fenol.

Pereaksi ini positif untuk protein yang mengandung asam amino dengan gugus samping senyawa fenol sebab terjadi reaksi antara senyawa raksa (II) dengan gugus hidroksifenil membentuk senyawa berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil positif.

5. Tes Biuret

Larutan protein memberikan hasil yang positif terhadap pereaksi biuret. Tes Biuret dilakukan dengan cara menuangkan larutan natrium hidroksida pekat ke dalam larutan protein. Kemudian, larutan CuSO₄ ditambahkan setetes demi setetes yang akan terbentuk warna ungu.

Gambar 1. Larutan protein memberikan hasil yang positif terhadap pereaksi biuret dengan terbentuknya warna ungu.

6. Tes Nitroprusida

Natrium nitroprusida dalam larutan amonia akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas (merkapto). Jadi, protein yang mengandung sistein akan memberikan hasil positif. Gugus –S–S– pada sistein apabila direduksi terlebih dahulu dapat juga memberikan hasil positif.

7. Pereaksi Ninhidrin

Pereaksi ninhidrin merupakan oksidator lemah, asam amino dapat bereaksi dengan ninhidrin sebagai berikut.

Selanjutnya, ninhidrin bereaksi dengan hidrindantin dan amonia membentuk senyawa berwarna biru.

PERMASALAHAN:

1. MENGAPA PADA REAKSI XANTOPROTEIN MENGGUNAKAN ASAM NITRAT PEKAT ? 

2. PADA REAKSI HOPKINS-COLE, ASAM OKSALAT DIREDUKSI MENJADI ASAM GLIOKSILAT DENGAN BANTUAN KATALIS SERBUK MAGNESIUM. MENGAPA KATALIS YANG DIGUNAKAN ADALAH SERBUK MAGNESIUM ? 

3. MENGAPA DAN APA YANG MEMBUAT PEREAKSI NINHIDRAN DIKATAKAN SEBAGAI OKSIDATOR LEMAH ? 

4. APA FUNGSI TES/REAKSI BIURET ?